không phải cứ cho agar nhiều là môi trường đông đặc, trước khi làm thí nghiệm, bạn cần biết một số thông tin về mối quan hệ giữa pH và chất kết đông, cũng như với một số thành phần khác của môi trường nuôi cấy.
Agar là một sản phẩm tự nhiên được ly trích từ các loại tảo đỏ Rhodophycean, như Gelidium, Gracillaria và Pterocladia. Agar là phức hợp của các polysaccharide được tạo từ đường và galactose. Agar gồm 2 phân đoạn: agarose và agaropectin. Agarose là một polymer trung tính, tạo nên tính đông của agar. Agaropectin là một polymer tích điện âm, làm cho agar có tính nhầy. Phân đoạn agarose trong agar chiếm 50 – 90% (Adrian & Assoumani, 1983). Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel, tan ra ở nhiệt độ 60 – 100oC và đặc lại khi nhiệt độ xuống dưới 45oC. Từ đây, chúng ta có thể lý giải: pH càng thấp thì nồng độ H+ càng cao, agar chuyển sang trạng thái nhầy (không đông), pH càng cao thì nồng độ H+ càng bị trung hòa nhiều khiến agar cứng (hay còn gọi là trạng thái gel).
Độ pH môi trường được đo dựa vào nồng độ in H+ trong môi trường. Độ pH biến thiên từ 0 – 14 và có điểm trung tính là 7. Độ pH môi trường cấy được điều chỉnh hầu hết ở 5,7 ± 1 trước khi hấp khử trùng. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Murashige & Skoog đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng độ pH 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS, pH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng.
Nếu trong thành phần môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm vi nói trên. Vì ở pH kiềm hoặc quá axit, GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Van Braft & Pierk, 1971).
Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống, do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ. Mặt khác, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính axit của môi trường nuôi cấy. Mann et al., 1982 nhận thấy rằng, nếu trước khi hấp tiệt trùng mà chỉnh pH bằng 5,7 thì sau khi hấp tiệt trùng, pH sẽ giảm xuống còn 5. Nếu muốn pH môi trường ở khoảng 5,7 – 5,9 trước khi cấy thì trước khi hấp khử trùng cần phải chỉnh pH đế khoảng 7.
Đối với các nghiên cứu về nuôi cấy lỏng không có agar, chẳng hạn như nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy thuỷ canh và vi thủy canh (hydroponics & microponic) trong môi trường không có agar nhưng tại sao chúng ta vẫn phải điều chỉnh pH môi trường? Như đã nói ở trên, Murashige & Skoog đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng độ pH 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS. Nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5. Huyền phù tế bào đậu nành có thể tăng trưởng tốt nhất trong môi trường B5 lỏng ở pH 4,5 – 5,5. Nếu như chỉnh độ pH môi trường trên 5 thì trọng lượng khô của tế bào sẽ giảm xuống đáng kể. Hơn nữa, môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào có pH thấp phần nào giảm bớt được trình trạng nhiểm vi sinh vật lạ (Veliky & Martin, 1970). Các môi trường nuôi cấy thủy canh phổ biến cũng sử dụng môi trường MS hoặc ½ MS.
Độ pH môi trường được đo dựa vào nồng độ in H+ trong môi trường. Độ pH biến thiên từ 0 – 14 và có điểm trung tính là 7. Độ pH môi trường cấy được điều chỉnh hầu hết ở 5,7 ± 1 trước khi hấp khử trùng. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Murashige & Skoog đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng độ pH 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS, pH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng.
Nếu trong thành phần môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm vi nói trên. Vì ở pH kiềm hoặc quá axit, GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Van Braft & Pierk, 1971).
Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống, do một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ. Mặt khác, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính axit của môi trường nuôi cấy. Mann et al., 1982 nhận thấy rằng, nếu trước khi hấp tiệt trùng mà chỉnh pH bằng 5,7 thì sau khi hấp tiệt trùng, pH sẽ giảm xuống còn 5. Nếu muốn pH môi trường ở khoảng 5,7 – 5,9 trước khi cấy thì trước khi hấp khử trùng cần phải chỉnh pH đế khoảng 7.
Đối với các nghiên cứu về nuôi cấy lỏng không có agar, chẳng hạn như nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy thuỷ canh và vi thủy canh (hydroponics & microponic) trong môi trường không có agar nhưng tại sao chúng ta vẫn phải điều chỉnh pH môi trường? Như đã nói ở trên, Murashige & Skoog đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng độ pH 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS. Nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh pH ở 5. Huyền phù tế bào đậu nành có thể tăng trưởng tốt nhất trong môi trường B5 lỏng ở pH 4,5 – 5,5. Nếu như chỉnh độ pH môi trường trên 5 thì trọng lượng khô của tế bào sẽ giảm xuống đáng kể. Hơn nữa, môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào có pH thấp phần nào giảm bớt được trình trạng nhiểm vi sinh vật lạ (Veliky & Martin, 1970). Các môi trường nuôi cấy thủy canh phổ biến cũng sử dụng môi trường MS hoặc ½ MS.
Văn Cương (Theo Sinh học Việt Nam
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét